本发明属于纳米抗菌复合材料制备技术领域，具体涉及一种改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料及其制备方法。

聚合物基无机纳米复合材料是一种将无机纳米材料与聚合物基复合形成的新材料，该材料将聚合物与无机纳米材料的功能协同起来，表现出无机纳米材料和聚合物共有的特性，在许多重要技术领域具有广泛的应用前景。在抗菌领域，纳米银因其具有强效抗菌和广谱抗菌的作用而被广泛使用。其抗菌机理是：纳米银通过释放出的银离子与细菌细胞膜上的磷化物和硫化物结合而破坏细胞膜的渗透性，在进入细胞膜后能继续与细胞内蛋白质和DNA上的硫化物或磷化物反应，阻断细胞内酶的功能和DNA的复制转录，从而起到抗菌作用。然而没有经过任何修饰的纳米银溶液极容易团聚，而且纳米银作为一种金属纳米材料，其对生物膜的穿透性效果不是很好，单独使用纳米银很难进入细菌细胞中发挥抗菌作用。以上缺陷都限制了纳米银在抗菌领域中的应用。

壳聚糖是一种环境友好的天然高分子材料，具有良好的生物相容性和可降解性，其分子中含有大量的氨基基团。壳聚糖的抗菌性来源于其分子结构中质子化的氨基。壳聚糖上的氨基也可以用于对材料进行改性处理，从而赋予材料一定的抗菌性。但是单独使用壳聚糖作为抗菌剂时，在中性或偏碱性环境下，由于质子化氨基的减少，壳聚糖抗菌性会大大减弱。因此制备壳聚糖与纳米银的复合材料成为一种理想的选择，这种复合材料既能克服壳聚糖在中性或碱性条件下抗菌性能的不足，又能稳定纳米银颗粒。张雨霏等人（壳聚糖纳米银溶液的稳定性及在织物抗菌整理上的应用，高等化学学报，2012,33,1860-1865）以硼氢化钠为还原剂，壳聚糖为稳定剂，制备了壳聚糖纳米银溶液，并考察了纳米银在体系中的稳定性及抗菌性。但是这种复合材料仅是简单的依靠壳聚糖上氨基与纳米银颗粒的弱相互作用复合，此外壳聚糖在中性或偏碱性的条件下依然不能为纳米银提供足够的亲水性和稳定性， 在高盐度的水溶液中也会造成壳聚糖纳米银复合材料的聚集。因此上述壳聚糖纳米银复合材料的稳定性不佳，从而限制了该材料在抗菌领域中的应用。为了解决这一问题，选用亲水性和稳定性更好的壳聚糖原料，并且对壳聚糖化学改性，使之能共价修饰在纳米银粒子表面形成纳米复合材料，成为一种必要选择。赵婷等（冠醚交联壳聚糖吸附原位还原制备纳米银，中国皮革，2006，35，26-29）使用冠醚交联壳聚糖做吸附剂和稳定剂，在水介质中使用水合肼还原硝酸银制备了一种复合纳米抗菌材料。通过冠醚与银离子的主客体作用，将壳聚糖共价修饰在纳米银表面。但是这种纳米复合材料依旧存在缺陷：一方面通过冠醚修饰改性壳聚糖的合成工艺十分繁琐，需要四步合成，每一步骤中都引入大量毒性有机溶剂并且中间产物需要提纯处理，成本较高；另一方面由于选用的壳聚糖分子量较高，制备的壳聚糖纳米银复合材料稳定性欠佳，在偏碱性条件下容易团聚，抗菌效果有限，且只能局限在作为涂饰剂在材料表面抗菌使用。

本发明的目的之一是针对现有技术存在的问题，提供一种能在高盐度和广泛pH范围内具有良好抗菌作用的改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料。

本发明所述的改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料，是表层为壳聚糖、内层为纳米银的核壳结构的复合材料，所述改性壳聚糖由可与纳米银粒子进行螯合作用的功能小分子与壳聚糖通过化学接枝而得，接枝率为5%~50%。

本发明选用低分子量且水溶性良好的壳聚糖为主要原料，利用含有可与纳米银进行螯合的功能小分子对壳聚糖进行化学改性，赋予壳聚糖一定的功能性。这种改性后的壳聚糖可以共价螯合在纳米银粒子的表面，制备出一种新型的改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料。这种抗菌复合材料能有机地将壳聚糖和纳米银的抗菌能力协同起来，具有更高的抗菌性能。此外，低分子量壳聚糖具有的良好水溶性，能够为纳米银提供良好的溶液稳定性，使得抗菌复合材料在高盐度和广泛pH值条件下依然能保持较好的稳定性和分散性，从而扩大了改性壳聚糖修饰的纳米银复合抗菌材料在抗菌领域的应用。这种抗菌复合材料不仅可以作为水性涂饰剂在材料表面发挥表面抗菌作用，还可以渗透到纤维类材料内发挥深度内部抗菌作用。

所述改性壳聚糖由可与纳米银粒子进行螯合作用的功能小分子与壳聚糖通过化学接枝而得，接枝率为5%~50%，通过调节功能小分子的接枝率可以制备表面不同修饰密度的纳米银复合材料；功能小分子的接枝率越低，纳米银表面会修饰上更高密度的壳聚糖，纳米银的亲水性和稳定性也会增加，但相应的成本也会增加。可以根据不同的抗菌应用来调节纳米银表面所修饰的壳聚糖密度。

优选的，所述改性壳聚糖由以下方法制得：将壳聚糖充分溶解在水中，制成壳聚糖浓度为0.02 mol/L的水溶液，向壳聚糖水溶液中加入壳聚糖氨基摩尔数5%~50%的功能小分子，以及与功能小分子等摩尔数的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为催化剂；30-80℃下，催化反应4-24h将功能小分子接枝到壳聚糖上，制备得到改性壳聚糖水溶液，透析冻干后得到化学改性的壳聚糖；所述功能小分子为一端带有羧基，另外一端为可与纳米银进行螯合作用的功能小分子，优选以下几种功能小分子： 

（1）                                                （2）（3）

（4）（5）

其中m=1~10。

优选的，步骤（1）中，纳米银粒子的粒度为1nm~100 nm；步骤（2）中，壳聚糖水溶液中的壳聚糖分子量为5000-50000，脱乙酰度>90%，其化学结构式如下：；

 式中，x为25~240，y为25~240。

纳米粒子的尺寸大小对于其能否顺畅进入细菌内并发挥抗菌作用有较大影响。当纳米银粒子尺寸大于100nm时，纳米银较难进入细菌内，抗菌性能下降。

优选的，所述的还原剂为硼氢化钠、硫代硫酸钠或双氧水。

本发明的目的之二在于提供制备所述改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料的方法，包括如下步骤：

（1）在200-1000 rpm转速搅拌条件下向10 ml浓度为0.1 mol/L的硝酸银溶液中加入30 ml 浓度为0.067 mol/L的还原剂，在0-30℃下反应2-10小时制备出纳米银粒子备用； 

（2）将壳聚糖充分溶解在水中，制成壳聚糖浓度为0.02 mol/L的水溶液，向壳聚糖水溶液中加入壳聚糖氨基摩尔数5%~50%的功能小分子，以及与功能小分子等摩尔数的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为催化剂；30-80℃下，催化反应4-24h将功能小分子接枝到壳聚糖上，制备得到改性壳聚糖水溶液，透析冻干后得到化学改性的壳聚糖；所述功能小分子为一端带有羧基，另外一端为可与纳米银进行螯合作用的功能小分子，优选以下几种功能小分子： 

（1） （2） （3）

（4）（5）

其中m=1~10。

（3）向所得改性壳聚糖水溶液中加入由步骤（1）所得的纳米银粒子，常温下搅拌反应0.5-2 h后得到改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料。优选的，所述的还原剂为硼氢化钠、硫代硫酸钠或双氧水。

本发明的目的之三在于提供另一种制备所述改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料的方法，包括如下步骤：

（1）将壳聚糖充分溶解在水中，制成壳聚糖浓度为0.02 mol/L的水溶液，向壳聚糖水溶液中加入壳聚糖氨基摩尔数5%~50%的功能小分子，以及与功能小分子等摩尔数的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为催化剂；30-80℃下，催化反应4-24h将功能小分子接枝到壳聚糖上，制备得到改性壳聚糖水溶液，透析冻干后得到化学改性的壳聚糖；所述功能小分子为一端带有羧基，另外一端为可与纳米银进行螯合作用的功能小分子，优选以下几种功能小分子： 

（1） （2） （3）

（4）（5）

其中m=1~10。

（2）向所得改性壳聚糖水溶液中，0-30℃下，滴加硝酸银溶液，所加硝酸银摩尔数为壳聚糖上所接枝功能小分子摩尔数的0.2-100倍，搅拌混合均匀，然后加入与硝酸银等摩尔数的还原剂，经原位还原后制得改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料。

优选的，步骤（2）中，纳米银粒子的粒度为1nm~100 nm；步骤（1）中，改性前壳聚糖的分子量为5000-50000，脱乙酰度>90%，其化学结构式如下：

 式中，x为25~240，y为25~240。

优选的，所述的还原剂为硼氢化钠、硫代硫酸钠或双氧水。

对本发明的制备方法而言，所述壳聚糖分子量为5000~50000，脱乙酰度>90%，具有良好水溶性，环境友好，原料廉价，来源广泛。壳聚糖主链上含有丰富的氨基，容易进行多种化学改性。

在纳米银制备过程中，反应温度、硝酸银浓度和还原剂浓度对所制备的纳米银的尺寸有着较大影响。当反应温度的升高时，还原反应加快，加速了布朗运动，使得纳米银之间的团聚几率增大，从而增大了所制得的纳米银的尺寸；当硝酸银溶液在一定浓度范围增大时，晶体增长的速度大于晶体成核的速度，所得纳米银的尺寸会增大，但当硝酸银溶液的浓度过大时，反应生成的银原子会生成新的晶核，成核过程中将消耗大量单质银，导致晶核生长过程中所需单质银减少，也会使得所得纳米银粒子尺寸减少；还原剂的浓度增大时，反应加快，使得纳米银粒子尺寸增大。将反应温度设定为0-30℃，硝酸银浓度为0.1 mol/L，还原剂浓度为0.067 mol/L，反应时间为2-10小时，能制得100nm以下且分散均匀的纳米银粒子。在对壳聚糖进行改性的过程中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）起到活化功能小分子上的羧基以便与壳聚糖上的氨基反应的作用。当1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）摩尔数与含有羧基的功能小分子相同时，能获得所期望接枝量的改性壳聚糖。

本发明的另外一个目的是提供所述改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料在抗菌领域的应用。本复合材料可以作为水性涂饰剂在材料表面发挥表面抗菌作用，还可以渗透到纤维类材料内发挥深度内部抗菌作用。

本发明与现有技术比较，具有如下显著的优点：

1. 原料来源广泛、价格低廉，制备工艺简单，反应条件温和，改性过程在水溶液中进行，并只引入少量的乙醇机溶剂，毒性小，对环境污染少；

2. 所得产品具有良好的水溶性，且能稳定分散于高盐度和广泛pH环境中，抗菌性能优异，能在条件复杂的工业领域应用；

3. 所得产品能将壳聚糖和纳米银的抗菌性高效的协同起来，抗菌性能优良，不仅可以作为水性涂饰剂在材料表面发挥表面抗菌作用，还可以渗透到纤维类材料内发挥深度内部抗菌作用。

本发明制备所述改性壳聚糖修饰的纳米银抗菌复合材料，既可以采用两步法，又可以采用一步法。两步法时首先利用还原法制备出纳米银颗粒，再用改性壳聚糖修饰在纳米银表面，两步法的优势在于改性壳聚糖可以修饰不同粒径的纳米银颗粒，修饰后的纳米银粒径分布比较小。

一步法时，是将即改性壳聚糖与硝酸银直接混合，利用改性壳聚糖上的氨基和羟基均匀分散硝酸银，然后加入还原剂原位还原纳米银，壳聚糖也同时共价修饰在纳米银表面。

二种工艺都非常简单，成本低廉，反应条件不苛刻，便于进行工业化的大批量生产。

图1 为实施例1中低分子量壳聚糖原料（Chitosan,CS）、硫辛酸原料(Lipoic Acid, LA)、硫辛酸接枝改性后的壳聚糖（CS-LA）以及改性壳聚糖修饰后的纳米银（CS-LAAgNP）等材料的红外谱图；

图2 为实施例1中改性壳聚糖修饰后的纳米银的TEM图，体现出很好的分散性；

图3为实施例1中未经过任何修饰的纳米银的TEM图，没有修饰的纳米银不稳定，容易聚集在一起；

图4 为实施例1中改性壳聚糖修饰的纳米银在不同pH条件下的紫外吸收谱图，在广泛pH值下纳米银的特征吸收峰没有变化，体现出良好的稳定性；

图5为实施例1中改性壳聚糖修饰的纳米银在高盐浓度水溶液中的紫外吸收谱图，在高盐浓度水溶液中，纳米银的特征吸收峰没有变化，体现出良好的抗盐稳定性；

图6为实施例1中改性壳聚糖修饰的纳米银材料制备工艺示意图。

图7为应用例1中的抗菌照片，左图为未涂饰壳聚糖纳米银皮样，右图为涂饰了壳聚糖纳米银皮样，结果显示涂饰了壳聚糖纳米银的皮样具有很好的抗菌效果。

具体实施方式：

实施例1

（1）改性壳聚糖CS-LA的制备

将壳聚糖充分溶解在水中，制成壳聚糖浓度为0.02 mol/L的水溶液；称取壳聚糖氨基摩尔数5%的硫辛酸，溶解于乙醇中，再加入与硫辛酸等摩尔量的EDC和NHS进行活化硫辛酸的羧基，混合后加入壳聚糖溶液中，30 ℃下反应4h；反应结束后透析除去未反应的硫辛酸以及EDC/NHS活化剂，反应液冷冻干燥后得到改性壳聚糖产物CS-LA，化学结构式如下：

 改性后的壳聚糖含有二硫键基团，可以用来共价修饰纳米银。

（2）纳米银的制备

向10 ml浓度为0.1 mol/L的硝酸银溶液中加入30 ml 浓度为0.067 mol/L的还原剂硼氢化钠，以1mmol的柠檬酸钠为稳定剂，在避光条件和1000rpm的搅拌速度下，反应2 h，得到柠檬酸钠稳定的纳米银粒子。柠檬酸钠稳定的纳米银不稳定，存放一定时间后容易聚集。

（3）改性壳聚糖修饰纳米银

将改性壳聚糖CS-LA直接加入到步骤（2）中的纳米银粒子中，常温反应0.5 h，CS-LA会逐渐取代柠檬酸钠，从而共价修饰到纳米银表面，经透析后得到改性壳聚糖修饰的纳米银复合材料（CS-LAAg NP）。

实施例2

（1）改性壳聚糖CS-LA的制备

将壳聚糖充分溶解在水中，制成壳聚糖浓度为0.02 mol/L的水溶液；称取壳聚糖氨基摩尔数50%的硫辛酸，溶解于乙醇中，再加入与硫辛酸等摩尔量的EDC和NHS进行活化硫辛酸的羧基，混合后加入壳聚糖溶液中，80 ℃下反应24h；反应结束后透析除去未反应的硫辛酸以及EDC/NHS活化剂，反应液冷冻干燥后得到与实施例1中步骤（1）相同的改性壳聚糖产物CS-LA；

（2）改性壳聚糖CS-LA溶解在水溶液中，向上述溶液中滴加硝酸银溶液，所加硝酸银摩尔数为壳聚糖上所接枝硫辛酸摩尔数的0.2倍，利用壳聚糖上的氨基和羟基稳定和分散硝酸银，然后加入与硝酸银等摩尔数的还原剂硼氢化钠，于0 ℃下，避光搅拌一段时间后原位还原为纳米银，并且表面修饰了壳聚糖(CS-LAAg NP）；

一步法原位还原改性壳聚糖修饰的纳米银工艺简单，降低了成本，有利于工业化大批量生产。

实施例3

（1）没食子酸改性壳聚糖CS-GA的制备

将壳聚糖充分溶解在水中，制成壳聚糖浓度为0.02 mol/L的水溶液；称取壳聚糖氨基摩尔数25 %的没食子酸，溶解于乙醇中，再加入与没食子酸等摩尔量的EDC和NHS进行活化没食子酸的羧基，混合后加入壳聚糖溶液中，50 ℃下反应24 h；反应结束后透析除去未反应的没食子酸以及EDC/NHS活化剂，反应液冷冻干燥后得到改性壳聚糖产物CS-GA，化学结构式如下：

（2）纳米银的制备

向10 ml浓度为0.1 mol/L的硝酸银溶液中加入30 ml 浓度为0.067 mol/L的还原剂硫代硫酸钠，以1mmol的柠檬酸钠为稳定剂，在避光条件和200rpm的搅拌速度下反应10 h，得到柠檬酸钠稳定的纳米银粒子。柠檬酸钠稳定的纳米银不稳定，存放一定时间后容易聚集。

（3）改性壳聚糖修饰纳米银

将改性壳聚糖CS-GA直接加入到步骤（2）中的纳米银粒子中，常温反应2 h，CS-GA会逐渐取代柠檬酸钠,利用没食子酸的酚羟基螯合到纳米银表面，经透析后得到改性壳聚糖修饰的纳米银复合材料(CS-GAAg NP）。

实施例4

（1）改性壳聚糖CS-GA的制备

制备过程如实施例3中步骤（1），并得到相同产物；

（2）改性壳聚糖CS-LA溶解在水溶液中，向上述溶液中滴加硝酸银溶液，所加硝酸银摩尔数为壳聚糖上所接枝没食子酸摩尔数的100倍，利用壳聚糖上没食子酸的酚羟基原位固定银离子，然后加入与硝酸银等摩尔数的还原剂硫代硫酸钠，于30 ℃下，避光搅拌一段时间后原位还原为纳米银，并且表面修饰了壳聚糖；

没食子酸的酚羟基不仅能够螯合银纳米粒子，也能螯合银离子，更适合原位还原，而且没食子酸本身就有一定的还原性，可以十分容易的得到改性壳聚糖修饰的纳米银（CS-LAAg NP）。

实施例5

（1）巯基丙酸改性壳聚糖CS-TA的制备

将壳聚糖充分溶解在水中，制成壳聚糖浓度为0.02 mol/L的水溶液；称取壳聚糖氨基摩尔数10 %的巯基丙酸，溶解于乙醇中，再加入与巯基丙酸等摩尔量的EDC和NHS进行活化巯基丙酸的羧基，混合后加入壳聚糖溶液中，60 ℃下反应20 h；反应结束后透析除去未反应的巯基丙酸以及EDC/NHS活化剂，反应液冷冻干燥后得到改性壳聚糖产物CS-TA，化学结构式如下：

（2）纳米银的制备

向10 ml浓度为0.1 mol/L的硝酸银溶液中加入30 ml 浓度为0.067 mol/L的还原剂双氧水，以1mmol的柠檬酸钠为稳定剂，在避光条件和500rpm的搅拌速度下反应5 h，得到柠檬酸钠稳定的纳米银粒子。柠檬酸钠稳定的纳米银不稳定，存放一定时间后容易聚集。

（3）改性壳聚糖修饰纳米银

将改性壳聚糖CS-GA直接加入到步骤（2）中的纳米银粒子中，常温反应1 h，CS-GA会逐渐取代柠檬酸钠,利用巯基螯合到纳米银表面，经透析后得到改性壳聚糖修饰的纳米银复合材料(CS-TAAg NP）。

实施例6

（1）改性壳聚糖CS-TA的制备

制备过程如实施例5中步骤（1），并得到相同产物；

（2）改性壳聚糖CS-LA溶解在水溶液中，向上述溶液中滴加硝酸银溶液，所加硝酸银摩尔数为壳聚糖上所接枝没食子酸摩尔数的50倍，利用壳聚糖上的氨基和羟基分散和稳定硝酸银离子，然后加入与硝酸银等摩尔数的还原剂双氧水，于15 ℃下，避光搅拌一段时间后原位还原为纳米银，并且表面修饰了壳聚糖 (CS-TAAg NP）。

应用例 1

皮革表面抗菌应用：

（1）蓝湿猪皮削匀-漂洗-复鞣-中和-加脂（选用易长霉的卵磷脂加脂剂）-水洗-挂晾；

（2）将皮样剪成直径为2 cm左右的圆形皮片，然后在紫外灯下对皮片两面灭菌处理；

（3）灭菌后的皮片浸泡在实施例1中的壳聚糖纳米银复合材料水溶液中，震荡30 min，取出后烘干；

（4）表面浸涂有壳聚糖纳米银抗菌材料的皮片放置于含有产黄青霉（蓝湿皮中常见霉菌）的琼脂培养基中，培养5 天后进行抑菌圈测定。

对比于赵婷等人报道的冠醚交联壳聚糖纳米银复合抗菌剂，壳聚糖硫辛酸纳米银抗菌剂的10 mg/l的浓度下抑菌圈达到20 mm，相当于冠醚交联壳聚糖纳米银复合抗菌剂在300 mg/l下的效果，抗菌能力提升30倍。

应用例2 

皮革深度抗菌应用：

（1）铬鞣后的蓝湿猪皮放入到浓度为10 mg/l壳聚糖纳米银水溶液中，在转鼓中转动30 min，使壳聚糖纳米银微粒充分填充在皮胶原纤维之间。填充后的皮革再用戊二醛复鞣，通过戊二醛将壳聚糖纳米银固定在皮胶原上；

（2）本应用例制得的猪皮皮革与常规工艺的猪皮皮革相比，皮板的物理机械性能提高，丰满度增加，柔软性无差异；

（3）添加纳米银的猪皮晾干、灭菌后剪成皮片，皮片放置于含有产黄青霉（蓝湿皮中常见霉菌）的琼脂培养基中，培养5 天后进行抑菌圈测定；其抑菌圈均达到20 mm以上，10天内观察发现，壳聚糖纳米银在皮革内具有持续抗菌能力。